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血檢TMB丨非小細胞肺癌患者中,高ctDNA TMB的患者PFS和OS越短?

日期:2019/3/22 12:58:58 發布人:

2019年初,《Nature Genetics》上一篇文章研究表明:基于組織樣本檢測的 tTMB-H 患者接受 ICIs 治療的總體生存率更好[1]。但是,基于血液檢測的 ctDNA TMB-H(或bTMB-H)患者,是不是接受 ICIs 治療的總體生存率也會更好呢?

本次介紹的回顧性研究答案是否定的[2]。與以往研究的tTMB相比,在這次的測試樣本中,較高的ctDNA TMB與較短的PFS和OS顯著相關。這是為什么呢?(這項研究也與去年《Nature Medicine》報道的 Atezolizumab 治療NSCLC的B-F1RST前瞻性數據形成了對比[3])

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臨床研究顯示,單獨使用PD-1/PD-L1抑制劑,只有20-40%的病人會對免疫治療產生反應[4,5]。識別對PD-1/PD-L1抑制劑有反應的患者的生物標志物是至關重要的。組織腫瘤突變負荷(tTMB)已成為預測PD-1/PD-L1抑制劑治療反應的一種可行的生物標志物,但很少有研究探討基于血液的無創TMB(ctDNA TMB/bTMB)的意義和潛在的臨床意義。

在非小細胞肺癌中,通常要做諸多分子檢測,例如EGFR,ALK,NTRK突變等,這就會導致組織標本的緊缺,大約有30%的患者無法再進行標準的組織NGS檢測,尤其在晚期腫瘤患者中很難獲取(足夠的)組織用于分子檢測,這時非侵入性的血檢就是一個非常好的替代手段[3]。考慮到獲取足夠的組織與非小細胞肺癌系列活檢相關并發癥發生率的技術挑戰,探索并建立ICIs反應的非侵入性生物標志物是至關重要的。

因為ctDNA是在腫瘤細胞生長到供血不足、缺氧、凋亡或壞死后主動釋放到血液循環系統中的[6],因此基于血液ctDNA的 TMB 檢測將會是一個新的生物標志物,本次介紹的就是ctDNA TMB在非小細胞肺癌中的臨床應用前景。

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Oncologist 2019 Mar 13(PMID:30867242)


一、研究背景

在非小細胞肺癌中,基于NGS panel檢測的組織腫瘤突變負荷(tTMB)已經成為預測免疫檢查點抑制劑 PD-1/PD-L1 免疫藥物臨床治療反應的潛在生物標志物,但是利用血液循環腫瘤DNA(ctDNA)檢測的血液腫瘤腫瘤突變負荷(bTMB/ctDNA TMB)還是比較少的。


二、材料與方法

對136例接受ctDNA檢測的非小細胞肺癌患者進行回顧性評估,并與來自第二家機構的驗證隊列進行比較。ctDNA TMB是利用NGS測序檢測到的突變數推導出來的。

檢測的材料:2015-2016年的樣本,一線接受免疫治療前或接受免疫治療后90天內采血,2管streck 10ml外周血;

ctDNA抽提試劑盒:Qiagen circulating nucleic acid kit;

檢測的產品:Guardant360,68基因(2015.05-2015.10)和升級后70基因(2015.10-2016.10)的panel;目前,Guardant360 檢測方法還沒有被臨床驗證來確定TMB,本文提供的分析僅用于研究目的(現在Guardant360是73基因,并在2018年2月獲得美國FDA的快速審批資格,有望成為首個FDA批準的全面液體活檢產品[7])

檢測panel大小:檢測約 13.8 萬個堿基,即約 0.138 MBp;

檢測儀器:Illumina HiSeq 2500 ;

測序深度:平均深度是≥15000X;

臨床敏感性:85%;

臨床特異性:>99%;

ctDNA TMB的算法:ctDNA TMB被定義為在已測序的ctDNA區域內檢測到的突變數量,使用檢測 panel 編碼區的 SNV 及 indel 突變(排除重排、融合和拷貝數變異),計算患者的ctDNA TMB,表示為:突變數/MBp。ctDNA TMB是通過三種不同的方法計算的:

方法一:VUS(意義未明變異)+ 同義突變;

方法二:VUS(意義未明變異)+ 非同義的潛在功能變體;

方法三:VUS(意義未明變異)+ 同義突變 + 非同義的潛在功能變體。

三種方法檢測的 ctDNA TMB 中位數分別為 14.5/MBp,7.2/MBp,21.7/MBp;本次分析使用的ctDNA TMB分析方法是方法一(除非有其他特別說明)。

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ctDNA TMB的三種不同計算方法

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基于包含所有檢測到的突變的人群中TMB評分的情況(方法一)

在136例患者中,影響(方法一)計算ctDNA TMB值的因素有年齡及吸煙史。性別、腫瘤組織學類型、樣本采集時的疾病階段、先前的治療路線、先前的放射治療以及EGFR或KRAS的突變與此次ctDNA TMB值均無太大影響。

PFS和OS分析:PFS和OS的評估采用 Kaplan-Meier 評估法,基于免疫治療起始日期,患者在2017年1月18日再次被審查:PFS(進展)或最后隨訪,OS(死亡)或最后隨訪。


三、研究的結果

一、高ctDNA TMB與吸煙史呈顯著正相關。然而,這項研究并沒有發現 C> A 突變的優勢(這在以前有吸煙史非小細胞肺癌患者的研究中,報道的更頻繁)[8],因此ctDNA TMB和吸煙史之間的關系應被視為初步的研究結果。

二、在接受免疫檢查點抑制劑治療的患者中(n=20例),較高的ctDNA TMB與較短的無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)顯著相關:ctDNA TMB-H 的患者 PFS 顯著縮短(紅色曲線)(圖A,45天 vs 355天),ctDNA TMB-H 的患者 OS 顯著縮短(紅色曲線)(圖B,106天 vs 未達到)。

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n=20,基于ctDNA TMB的 ICIs 治療患者的PFS和OS

在一個小的獨立驗證隊列中(n=12例),ctDNA TMB越高,預測 OS越短,而PFS則不是(數值差異不顯著):ctDNA TMB-H 的患者 PFS (紅色曲線)與 ctDNA TMB-L的患者PFS(藍色曲線)無差異(65天 vs 64天),ctDNA TMB-H 的患者 OS 顯著縮短(紅色曲線)(236天 vs 511天)。

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n=12,基于ctDNA TMB的 ICIs 治療患者的PFS和OS

三、同時,本研究還發現,在接受免疫檢查點抑制劑治療的患者中(n=20例),較高的 MAF(突變等位基因頻率,Mutant Allele Frequency,可以理解為基因的突變頻率)與較短的無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)顯著相關:MAF-H(紅色曲線)與較短的PFS顯著相關(圖A,51天 vs 355天),MAF-H(紅色曲線)也與較短的OS顯著相關(圖B,135天 vs 未達到)。在驗證隊列中(n=12例),MAF越高,預測 OS越短,而PFS則不是(數值差異不顯著):MAF-H 的患者 PFS (紅色曲線)與 MAF-L的患者PFS(藍色曲線)無顯著差異(圖C,44天 vs 114天),MAF-H 的患者 OS 顯著縮短(紅色曲線)(圖D,236天 vs 595天)。

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基于MAF 的 ICIs 治療患者的生存曲線,包括PFS和OS

ctDNA MAF 可能反映腫瘤負荷,對接受靶向治療或PD-1/PD-L1治療的患者具有實時監測的潛在作用。ctDNA MAF是較短OS的預后標志物。


四、研究的結論

在目前的商業檢測 panel 下(Guardant360),較高的ctDNA TMB反映了NSCLC患者較差的臨床結果(PFS和OS)。


五、為什么ctDNA TMB-H的NSCLC患者,接受PD-1/PD-L1免疫治療的PFS和OS就越差呢?

1,機制假說,更多的組織基因突變可能預示著腫瘤產生更多的新生抗原,誘導腫瘤周圍細胞毒性T淋巴細胞的流入。然而,ctDNA TMB的生物學特性可能會有很大的不同,因為ctDNA只有在腫瘤將ctDNA轉移到血液中時才能被檢測到。以前的研究表明,ctDNA的數量可能預示著更嚴重的疾病和更高的整體腫瘤負荷。在轉移性乳腺癌的常規治療中,較高的ctDNA突變負荷與較短的進展時間有關[9]。因此,相對于細胞毒性效應T細胞的新抗原位點,ctDNA TMB本身可能反映了更大的腫瘤負荷。

2,該研究者在以前配對的患者樣本中發現組織TMB(tTMB)和ctDNA TMB(bTMB)之間的相關性較低,了解不同測序技術比較的局限性(與組織相比,血液中ctDNA的含量很低,這在檢測方面也存在很大的局限性。為了評估ctDNA與tTMB的一致性,有必要進行前瞻性研究,探索具有更多突變的更長的ctDNA檢測panel),這可能表明 tTMB 與 bTMB 這兩個生物標志物是差異預測因子[10]。

3,先前的研究表明,腫瘤負荷與更大的腫瘤異質性相關[11]。在腫瘤負荷較高的患者中,可能有更多的ctDNA進入血液,從而檢測到更多的ctDNA,ctDNA突變負荷可能更能反映腫瘤內異質性,更好地反映TMB的整體情況,這是組織活檢固有的局限性。先前的多項研究已經證明突變亞克隆性是一種與低存活率相關的生物標志物[12,13],假設ctDNA TMB的異質性更大(例如,更高),MAF定量反映腫瘤體積較大,提示接受PD-1/PD-L1治療的患者預后較差。

4,這是首次利用商業上可用的檢測方法將 ctDNA TMB 作為非小細胞肺癌患者的生物標志物進行檢測的研究之一。這個研究有幾個局限性:

首先,本次研究中使用的 ctDNA 檢測panel是 Guardant360 68/70基因panel,panel的size比較小,只有 0.138MBp,因此在估算ctDNA TMB時,可能不能反映組織癌基因組的體細胞突變率(tTMB檢測的panel建議>0.5MBp,一般在1.0MBp以上最好)。

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目前的建議包括使用實體組織樣本,使用覆蓋率大于0.8 MB(最好大于1 MB)的基因panel

其次,本次的研究結果只反映了單個商業可用平臺的ctDNA TMB,因此檢測血液基因組變化的檢測技術規范可能不反映其他ctDNA檢測平臺(比如Foundation,PGDx ctDNA檢測平臺)。

✦ 再次,本研究將ctDNA TMB作為PD-1/PD-L1的預測因子,用于生存分析的樣本量很小。

✦ 最后,本研究在分析中結合了幾種抗PD-1/-PD-L1的治療方法,進一步的研究應該在更大的隊列中分別探索每種抗PD-1/PD-L1抑制劑的療效。


總之,此次研究結果證明了在非小細胞肺癌患者中檢測ctDNA TMB的可行性。有趣的是,與組織相比,此次分析表明,對于接受免疫檢查點抑制劑(PD-1/PD-L1)治療的患者,較高的ctDNA TMB與較短的PFS和OS相關,這可能是由較高的腫瘤負荷介導的。同時,MAF作為反映血液高突變和腫瘤異質性的無創預后生物標志物,可作為非小細胞肺癌免疫檢查點抑制劑反應的標志物。


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